Experiment

  1. Endnote添加书籍参考文献

    Endnote用过和听说的都觉得好。在论文写作中,参考文献管理,endnote具有明显优势。

    除了常规参考文献,有时我们也涉及书籍类参考文献。endnote同样可以轻松实现:

    1. 打开如下网址:

    https://www.worldcat.org/

    2.在检索栏输入书籍名称:

    3.在检索结果界面依次选择红色cite/export,然后在下载界面选择endnote就可以了。

    PS:然后通过endnote软件导入下载的参考文献就能像常规参考文献导入和编辑 了。 :-)

  2. Image J/Fiji插件之划痕实验分析

    作为常用而几乎万能的软件,Image J/Fiji当然是能够完成划痕实验定量分析的。以下就是插件的主要界面:

    1.下载解压插件,并拷贝到Image J/ Fiji的plugin目录,

    2.打开软件后所见如下面板,并以此点击红色自选项后调出蓝色面板:

    3.右键以上蓝色选项设置划痕实验分析参数:

    4.左键蓝色选项就会生成如下结果:

    PS:插件功能很强大,可以美化划痕图片边缘,并导出tiff图片。 :-)

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  3. 文章中引入网页链接式参考文献-Endnote篇

    写/修改文章时,常常会遇到非规则的参考文献需要被引用,比如网页链接形式的参考文献。对于重要的官方资料有的时候确实没有被pubmed收录,但是又不得不引用。

    于是Endnote的强大之处就体现出来了,用过Endnote的都说好,还是有道理的。

    通过Endnote插入网页链接或者任何形式非常规参考文献均可以参考以下方法:

    一。通过Endnote主界面手动新建目标参考文献:

    二。在弹出新建界面选择weblink模式,其实此处可以发现许多其他方式也可以被建立:

    三。选择Web模式后,尽可能多的输入信息,尤其是对于链接发表的组织和link一定不能有错误:

    四。完成后的效果就是这样的了:

    最后,就可以像其他的参考文献那样正常的引用和编辑了。 :-)

  4. 人脐带平滑肌细胞培养

    材料:

    新鲜脐带
    方法:
    冰冷无菌D-Hanks液中漂洗,用眼科剪仔细清除脂肪、包膜、血管等组织,转入青霉素小瓶中,加入少量无菌D-Hanks液,用眼科剪剪成0.1-1.0mm3大小的碎片,用滴管轻轻吸出上层细小脂肪碎块和油滴,再用无菌D-Hanks液反复清洗8~10次,加入10倍体积无菌胶原酶消化液(1mg/mL),室温消化30min,1000rpm离心5min,弃上清,加1mg/mL胰蛋白酶37℃消化20min,1000rpm离心5min,弃上清,再加入胰蛋白酶37℃消化20min,1000rpm离心5min,弃上清,加胶原酶(1mg/mL)弹性蛋白酶(0.5mg/mL)混合消化液37℃消化20min,1000rpm离心5min,弃消化液,再加混合消化液37℃消化20min,1000rpm离心5min,细胞加10%FBSDMEM培养基重悬,转入培养皿37℃5%CO2培养箱中培养即可。
  5. MTT试验——细节决定成败

    一、关于如何计算IC50
    1、改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
    Xm:lg 最大剂量
    I:lg(最大剂量/相临剂量)
    P:阳性反应率之和
    Pm:最大阳性反应率
    Pn:最小阳性反应率
    举个例子:各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001,稀释倍数为10,最大浓度为0.1,抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21,0.06。代入计算公式:
    Pm=0.95
    Pn=0.06
    P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1
    Xm=lg0.1=-1
    lgI=lg0.1/0.01=1
    lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025
    IC50=0.00025
    2、Bliss法:自己查阅书籍
    3、IC50计算软件
    4、自己用EXCEL做趋势线来求IC50,关于LD50的方法与此相似!
    5、在线求IC50或EC50:http://chiryo.phar.nagoya-cu.ac.jp/javastat/JavaStat-j.htm
    二、结果统计学处理
    所有数值以x±s表示,应用SPSS软件进行方差分析,p<0.05时为相差显著,p<0.01时为相差非常显著。可以以时间为横轴,光吸收值为纵轴绘制细胞生线,专门公式求IC50。或计算抑制率。细胞死亡率%=OD对照组-OD实验组/OD对照组excel表中可以做两两比较的T-test,这个你可以参考一下;你的数据应该用多个样本均数的T-test,方差分析也可。用的软件是SPSS或者SAS。
    三、孔板的重复利用
    培养板要用好的(最好进口板),不好的板或重复利用的板只可做预实验。一般贴壁生长的细胞用重复利用的培养板效果不是很好,因为培养板表层在生产时涂有一层促进细胞贴壁的物质,在清洗后多半会失去。悬浮或是半悬浮生长的细胞还可以。建议不要用太多次,即使是进口的板子使用次数也不要超过3次,底值最好在测得值的1/3一下。
    强烈建议培养板不要重复使用:1、泡酸是可以,但是泡完酸的板子很不利于细胞的生长,会出现帖壁不好,细胞生长缓慢等情况.2、这样的板子消毒灭菌很不彻底,如果有万一,则因小失大.3、重复用的板子洗不干净在培养过程中易出现杂质.
    重复利用时
    做法1:
    洗净后用2%NaoH浸泡4小时,再用1%稀盐酸浸泡4小时,冲洗15遍,蒸馏水冲洗3遍,烘干,UV照射过夜(紫外2小时以上消毒即可)
    做法2:
    泡酸2-4小时,老师让我们别超过4小时,(普通的玻璃仪器是过夜)。捞出,冲洗干净,烘干后,UV 照射过夜。估计跟其他收集在一起,钴60照射消毒.
    做法3:
    1.做完MTT后用大水流尽量将板冲净,然后用洗衣粉水泡几个小时(小心最好让洗衣粉先化开)。
    2.用自来水冲净洗衣粉水,倒扣晾干。
    3.重铬酸钾加浓硫酸配成的酸液中浸泡过夜泡洗液(六小时以上即可)后自来水洗净(20次左右)每个孔都要处理。
    4.用去离子水冲洗3遍,双蒸水冲洗3遍,烤干5.超净台中紫外线照射2个小时左右,就可以用了,不可以高压。
    做法4:
    1、测完值的96孔板甩掉孔内培养液,放入超声中超10-30分钟,晾干(或烘干)备用。此步骤可最大程度的洗去污垢及细胞。
    2、每孔加入50-100ul的胰酶(0.05%),我一般加60ul,加完胰酶后水平振荡96孔板以使胰酶均匀覆盖于细胞表面,室温下放置至细胞被消化脱落为止。假如你想消化快一点的话可将96孔板放到37度培养箱内(胰酶在37度时的活力最大)。对于顽固贴附在壁上的细胞,此步骤最为有效。
    3、甩掉胰酶,自来水下冲洗,晾干(或烘干)备用。如果不烘干就泡酸,那么96孔板残留的水分将稀释酸液,长期以往泡酸的效果下降。
    4、将晾干的96孔板泡酸(中强酸)过夜,捞起后自来水下冲洗10遍;双蒸水冲洗3遍。三蒸水冲洗3遍。烘干备用。泡酸时特别注意时间不要太长了,否则板子变黄,影响最后的OD值的测定。
    5、做实验前,96孔板至少在紫外灯下照射30分钟,但不能长期照射。紫外线长期照射可使板变黄,我的两块板放在超静台上忘了拿出来,一直照了两个星期,等我从超静台上取出板已经变成黄色。
    注  意:
    1、在实验中若你测得某一个孔的数值偏高,虽然有很多因素会导致数值偏高,但是如果是板底的污点引起的话你可以消除。拿出96孔板擦一擦值偏大孔的板底部,再测值。你会发现孔高的值又会到正常水平。因为咱们做实验时手不可避免的接触96孔板板底留下痕迹,这些痕迹就会使吸光度升高。
    2、96孔板洗的次数多了,板底自然留下划痕,这就会导致读数的不均而影响实验结果。你不妨在做实验前测一次96孔板的值(此值为初值),实验测得的为后值。后值减去初值就接近实验的真实值。
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  6. 成纤维细胞的培养和形态

    (一)  原代培养

    1、在手术室无菌条件下,切取新鲜的皮肤,增殖性瘢痕和瘢痕疙瘩组织,修除表皮和皮下组织,盐水反复冲洗后放入含PS的DMEM培养液内带回无菌工作间。

    2、把组织块置于培养皿内,Hank,s液漂洗三遍后吸净Hank,s液,眼科剪反复剪切组织块成0.5-1mm3大小。用弯头吸管吸取组织块接种于40ml培养方瓶瓶壁上,组织块间留约0.3-0.5cm的间距。

    3、 塞好瓶塞,放入37℃电热恒温培养箱内3.5小时使培养的组织小块微干涸。

    4、从温箱中取出培养瓶,向瓶底轻轻注入含20%CS及PS的DMEM培养液5ml,然后缓缓翻转培养瓶,让培养液慢慢覆盖附于瓶壁上的组织小块,置于37℃温箱内培养。

    5、一周后取出培养瓶,弃去瓶内培养液,Hank,s液漂洗两次后加相同的培养液5ml继续培养。以后待细胞萌出后,同样方法每周换液两次。

    (二)传代培养

    待原代培养细胞生长基本融合成片时即可传代。

    1、吸出培养瓶内的培养液,Hank,s液漂洗两次,向瓶内加入0.5%的胰蛋白酶溶液少许以覆盖瓶底为度。

    2、大约1分钟左右,镜下观察细胞胞质回缩,细胞间隙增大时立即吸出胰蛋白酶液,加入DMEM培养液终止消化。

    3、用吸管吸取培养液轻轻反复吹打瓶壁细胞使之脱落形成细胞悬液,按1:3比例分装传代,加入足量的DMEM培养液后置于37℃恒温培养箱内培养。

    4、每周换液两次,待细胞融合成单层再次传代。本实验均在第4-8代进行。

    一、胰酶消化法的效果一般都不太好,不很确切,最好采取组织块法,虽然周期长些,但效果比较好。也可以两种方法一起采用,可以做到万无一失!

    二、采取组织块法时应注意组织块的贴壁,应待组织块贴附于瓶壁上后再加培养液,防止组织块浮起

    三、注意无菌操作

            细胞培养材料取病人手术切下的病理性瘢痕组织及其周围正常组织。取材部位为前胸、四肢等,病人年龄从3到35岁,瘢痕生长时间为6个月到1.5年。采取组织块贴壁法进行成纤维细胞培养。在手术室无菌条件下将手术切下的病理性瘢痕及周围正常组织小心去除表皮及皮下脂肪组织,然后在超净工作台上用眼科剪刀将组织剪成大小约 0.5-1mm3的小块,加入少量小牛血清,接种于培养瓶中,在95%空气,, 5%CO2, 37度, 饱和湿度条件下培养24小时,使组织块牢固贴附于瓶壁。 然后加入适量含20%小牛血清、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的DMEM培养液继续培养,每周两次换液。约3-4周,原代培养细胞生长成细胞单层。用0.25%胰蛋白酶消化以后,以1:2的比例传代培养。每隔两天用含10%小牛血清的DMEM培养液换液一次,待细胞铺满瓶底后传代。实验选用3-10代细胞。

            组织块不需要剪成很小的块,有时候剪成3mm见方的块也能长得很好。瘢痕疙瘩去除表皮和核心,只要比较靠外侧的部分,在PBS中剪切(这点很重要,不要让组织块干燥!)。培养皿中可以先涂较薄的一层含血清培养基,再将组织块贴上去,密度高一些,便于细胞融合。4-10小时后加少量培养液,不要让组织块浮起!!以后几天不要动他,最快3-4天就可以有细胞爬出了!

    细胞需要传代时,要先用无菌的小镊子将组织块夹出,再用0.25%胰酶(含0.02%EDTA)消化即可。

    如果细胞来自瘢痕疙瘩,在DMEM培养2-3代之后就基本上全是成纤维细胞了,没有特殊原因不需要鉴定。

            材料:对遗传咨询门诊疑为Turner’s征的患者取前臂内侧皮肤,或手术切口部位皮肤。取材前用清水洗净,酒精消毒,待干后用取皮器取皮肤表皮,不要深至皮下组织,以取皮后皮下组织无出血最为恰当,立即将组织浸入HamF10+抗菌素溶液中浸泡1h送实验室。方法:将组织块取出,用F10溶液冲洗两次,在高压消毒的平皿中,用眼科剪将组织剪或2mm3大的组织块,贴于含2.5ml培养液的组织培养瓶中,使瓶立置4~6h,再平置,以保证组织块不致脱壁。培养液:可选择HamF10+小牛血清+Hepes+抗菌素,调pH为7.2~7.4,其成份见附表。培养箱:采用普通恒温培养箱闭式培养。  观察方法:待接种后第5d,给予换液,容积为25ml的培养瓶加2.5ml培养液,40ml的培养瓶内加4ml的培养液。一般7~10d开始长出成纤维细胞,在倒置显微镜下见组织块周边滋出梭形、折光性好的透亮细胞,以后3d换液1次,至第14~16d时可见圆形细胞较多时或成纤维细胞面积超过一个低倍视野时,可传代培养或收获为核型分析用,或用作酶测定,也可贮存细胞株于液氮中。

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  7. 各种荧光检测方法简介

    很多细胞实验都要检测荧光,为方便大家选择合适的方法,在此简单说一下各种荧光检测方法的特点。不足的地方,欢迎大家补充:
    1、流式,优点是速度快,非常适合做大数量统计,且样品只被检测一次,完全不用担心荧光淬灭的问题。缺点是只能检测荧光的有无、强度大小,无法提供空间定位信息,无法做荧光定位变化的实验;由于样品只被检测一次,因此无法对同一个样品进行连续观察。例如,做膜蛋白定位时会得到这么一个结果——用流式可以检测出信号,但是用显微镜却看不到东西,排除仪器和滤光片选择问题,很可能是核的自发荧光或非特异标记造成流式的假阳性结果。
    2、荧光显微镜,刚好与流式互补,可很好地进行空间观察,判断目标蛋白的定位,但是不适合做大流量检测,估计没人能经得起时间的考验。有不同倍率的物镜选择,可以使用高倍物镜看精细结构,或用小倍率物镜做少量统计。与之搭配的CCD和软件,是系统能否发挥性能的关键。尤其是CCD,从那么多商品里选一款合适的不容易,需要了解很多知识否则只能听别人忽悠。
    3、共聚焦,荧光显微镜的升级产品,具有很好的光学层切效果,能得到很好三维定位信息。但是,如果使用共聚焦的目的仅仅是为你的样品拍一张靓照,取得一张好看的图片,就让人觉得可惜了。共聚焦基本都是全自动系统,可随意定义照明区域、选择多个荧光通路和设定定时取图,所以,做Time-laps、FRAP和FRET有其独到的优势。另外,4Pi和STED又是其中的极品,具有超高的空间分辨率,只是使用不方便,未必适合做生物实验。
    4、全内反射,荧光显微镜的另一种升级产品,属于近场光学范畴,只适合且最适合做膜研究,无法看到胞内信息。也是用CCD成像,但是对CCD的要求更高——个人甚至觉得对CCD的要求是没有上限的。
    5、双光子,另一种共聚焦,因使用长波激发荧光,故能做深层检测(突破共聚焦的100微米极限),最典型的应用是观察活体脑组织。巨贵无比,国内没有几台,能用上的人不多——就不说了。
    6、新推出的高内涵药筛系统,流式和显微镜的杂合体,使用电动载物台,可以自动地按预定程序完成实验,可做大流量检测(虽然速度慢点),而且有成像能力,可以判断定位。前段时间,国内哪装了第一台,很多人在吹,但我实在不知道其中的好处——任何一台带电动载物台的显微镜都可以达到相似的效果,只要软件支持——估计有人赚大发啦!
    从以上的简介可以看出,只要是荧光样品,就应该都可使用以上仪器检测(只用TIRF受一些限制)。但是实际应用时,大家可能会碰到某些样品可以使用流式和显微镜,但是无法使用共聚焦。为什么?解释一下:
    首先,荧光检测必须有激发光照明,染料被特定波长的光照射以后才能发射荧光。激发光源有两种:1)白光(汞灯、氙灯等),然后通过滤光片选择只通过特定波长的光。如检测GFP时,大家能看到蓝光照射在样品上,因为GFP的激发条件是488nm 光。但是有一点,显微镜不可能装无限多的滤光片,所以选择是有限的。2)激光,普通的激光器只能发射特定波长的光,且数量有限,常见的是405、488、514、543、633等,所以可使用的染料也是有限。因此,大家判定仪器能否满足你实验要求,务必先看看激发条件是否合适。
    其次,在光检测器(PMT、CCD)前还有一块滤光片,作用是反射样品各种散射光,只通过特定波长的荧光,提高信噪比,得到干净的背景。因此,这块滤光片也决定了仪器能否满足你的实验要求(不用太担心,这个一般和激发滤光片配套,不会有太多问题)。而在光谱型共聚焦里,使用的是棱镜或衍射光栅分光,可以选择通过任意需要的波段。这对使用量子点做标记的同学特别有好处!

  8. 细胞免疫荧光步骤

    1.细胞爬片;

    2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮);

    3.PBS漂洗5min;

    4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理);

    5.PBS漂洗2次,每次5min;

    6.1%BSA封闭30min;

    7.加入1%BSA稀释的一抗,于37℃杂交2h;

    8.PBS漂洗2次,每次5min;

    9.加入1%BSA稀释的二抗,于37℃杂交1h;

    10.PBS漂洗2次,每次5min;

    11.5ug/ml DAPI染色2min;

    12.抗淬灭封片剂封片。

    抗淬灭封片剂:

    2.5% DABCO (w/v)

    50mM Tris(pH8.0)

    90%甘油

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  9. 单细胞凝胶电泳步骤

    1分离制备单细胞悬液:

    (1)体外培养的细胞株:用胰酶消化,最后用PBS悬浮吹打成单细胞悬液,细胞要计数,具体的量我前边已经说过。

    (2)体内脏器细胞:处死动物,取出脏器,于Hanks’液中制备成单个细胞悬液。

    2胶板制备:

    (1)取100μl于45℃水浴中保温的0.5%NMA,铺于磨沙载玻片上,形成底胶。盖玻片推匀,不能有气泡,4度凝固5至8分钟。

    (2)水平取下盖片,取100μl于37℃水浴中保温的0.5%LMA与20μl细胞悬液(约400个细胞)混匀,立即铺片,加上盖玻片,4度凝固5至8分钟。

    3细胞裂解与电泳:

    (1)将制备好的胶板去掉盖玻片后,浸于4℃预冷的细胞裂解液中,在4℃下裂解2.5到3小时。

    (2)取出胶板,用双蒸水浸没漂洗后放入电泳槽中,浸泡在4℃预冷的电泳液中解旋20分钟。

    (3)玻片水平放置阳极端附近,4℃电泳20到25分钟(25V,300mA)。可在电泳槽周围加冰块以保持低温。

    4中和与染色:

    (1)电泳结束,将胶板浸泡于中和液中,每次10分钟,共中和3次,每次要更换中和液。最后晾干。

    (2)取出胶板,置于染色缸中,在2μg/ml的EB染色液中,暗处染色5到10分钟。

    (3)蒸馏水漂洗2次,每次5分钟。

    稍晾干,滤纸吸去多余水分,尽快在荧光显微镜下观察。

    从胶板制备开始到最后都应该在暗光下操作。

    辐射生物剂量:此法适于照后短期内的剂量评价,中性条件优于碱性条件;

    旁观效应:查阅了许多国外文献,尚无此方法观察旁观效应的研究报道,所以我采用此方法观察了1Gy照后的旁观效应,试验今天上午刚刚结束,结果待分析,粗略看,此法对于旁观效应还是很敏感的,此法的优势在于成本低,操作比较简单。

    低剂量照射的适应性反映:本实验室的一个相关课题刚刚结提,论文在法医学与特种医学版的军事医学子版已有上传,感兴趣的可以去看。

    凋亡细胞的观察:看过国外此法作出的凋亡细胞彗星图像,很漂亮,用CASP软件分析后,其曲线呈典型的双峰,而正常细胞为单峰。我的一些教训:观察凋亡细胞最好把电压、电流、和电泳时间均调低,否则,凋亡细胞中的DNA片断跑的太块,荧光下根本看不到凋亡细胞的尾巴。

    注:我用的是中性条件,20V,200mA,20min, 凋亡细胞观察宜选用10V,100mA,10min。

    单细胞凝胶电泳技术应用非常广泛,本单位正在进行荷瘤小鼠放疗后的淋巴细胞DNA损伤研究,初步结果:大剂量放化疗前给予小剂量照射(分不同时间),动物的淋巴细胞彗星尾长、尾矩等指标试验组均小于对照组,证明该方法在放射医学的实用性。

    丁香园网友biomed96提问:

    lq6688你好,本人也正要做这个实验,预实验做了两次,但什么都没看到,也不知道是什么问题,望指教。

    铺3层胶,第一层100ul1%regular胶,50度烤干,第二层50000个细胞100ul0.5%低熔点胶,第三层100ul 0.5%低熔点胶。

    裂解液:EDTA 100mM Nacl 2.5M Tris(10mM)pH10 1%TritonX-100 裂解 1小时

    解旋液:EDTA1mM NaoH 300mM Ph>13 孵育20分钟。电泳40分钟。

    染色: PI 50ug/ml染色15分钟。

    结果是什么都看不到,好像一点都没染色。

    另外,用软件分析能不能区分是单链损伤还是双链损伤?

    丁香园网友lq6688认为:

    首先,此试验的生物学原理目前还不是很清楚,Sighn和Olive这两个单细胞凝胶电泳的鼻祖首先提出的中性和碱性条件,中性条件检测双链断裂,而碱性条件检测单链断裂,有人曾提出这是为什么,我查阅了大量文献,国外文献没有具体的说明,国内文献更是人云亦云,所以,目前只能按照大家比较默认的:中性--双链,碱性--单链,这不是用软件来区分的,而是你的试验条件决定的,我看了您的裂解液ph10,所以检测结果应是单链断裂。

    其次,您用的是三层三明治铺胶法,目前多数彗星试验已经少用此法,而是双层法甚至单层灌胶,有人担心双层或单层铺胶的脱胶问题,只要在凝胶的承载载体上做点文章,就解决了!我用的是双层铺胶法,我不知道您的第一层正常熔点胶为什么要烤干,是为了防治脱胶吗?我建议您采用双层法(卖瓜人不说自己的瓜苦,呵呵),这样在实验操作上可以节省时间,不必担心脱胶问题,我做了一年多了,自认为很成熟了,从来没有出现脱胶问题,(我不知道您用的凝胶承载体是什么?)。

    第三,解旋20分钟应该没问题,但是我认为您的电泳时间过长,当然我不知道您的电泳条件(电压、电流、),我认为20分钟足够了,时间长了一是浪费时间,二是彗星图像不好,不利于分析。

    第四,因为我用的EB染色,2ug/ml,效果很好,您用PI染色,我可能没有发言权,因为我不知道PI 的荧光激发光波长是多少,是否您的荧光条件不对?可以查查文献,这一点您对PI应该比我更了解吧。

    第五,您的裂解时间有点短了,文献报道,最好不要少于1.5小时。

    第六,我不知道您用的什么细胞,50000个细胞加入100ul0.5%低熔点胶,是不是细胞太多了,含细胞层的凝胶如果细胞密度过大,即使做出结果,彗星图像过于密集,头尾连接互相影响,无法分析。一般100ul0.5%低熔点胶中含400个细胞就足够了。

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  10. 激光共聚焦的前期步骤

    1、做细胞爬片(爬片的步骤就不详述了),注意:洗片子的PBS和固定用的4%多聚甲醛一定要新鲜配制的(一周以内的都能用), 因为PBS和4%多聚甲醛放久了后,都会有自发荧光。

    2、抗体的孵育:预实验的时候荧光根据文献和经验设定一、二抗的浓度,一抗4度孵育过夜(时间8~12h);二抗(荧光抗体)孵育时要避光,孵育好后用PBS充分冲洗;可以将做好的片子直接在板子中孵育,如果从节约的角度来看,可以用12或24孔板比较好。

    3、做好以上步骤后,将板子里放点PBS,保存片子湿润,不要干片,这样会影响细胞形态。

    4、到激光共聚焦观察室后,再将爬片取出,在干净的载玻片上滴一滴50%的甘油,然后将爬片取出来倒扣在滴过甘油的载玻片上(即细胞在2层玻片之间,一定不要反了哦;还有千万不要用中性树胶封片!

    5、显微镜下观察即可。