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1分离制备单细胞悬液:

(1)体外培养的细胞株:用胰酶消化,最后用PBS悬浮吹打成单细胞悬液,细胞要计数,具体的量我前边已经说过。

(2)体内脏器细胞:处死动物,取出脏器,于Hanks’液中制备成单个细胞悬液。

2胶板制备:

(1)取100μl于45℃水浴中保温的0.5%NMA,铺于磨沙载玻片上,形成底胶。盖玻片推匀,不能有气泡,4度凝固5至8分钟。

(2)水平取下盖片,取100μl于37℃水浴中保温的0.5%LMA与20μl细胞悬液(约400个细胞)混匀,立即铺片,加上盖玻片,4度凝固5至8分钟。

3细胞裂解与电泳:

(1)将制备好的胶板去掉盖玻片后,浸于4℃预冷的细胞裂解液中,在4℃下裂解2.5到3小时。

(2)取出胶板,用双蒸水浸没漂洗后放入电泳槽中,浸泡在4℃预冷的电泳液中解旋20分钟。

(3)玻片水平放置阳极端附近,4℃电泳20到25分钟(25V,300mA)。可在电泳槽周围加冰块以保持低温。

4中和与染色:

(1)电泳结束,将胶板浸泡于中和液中,每次10分钟,共中和3次,每次要更换中和液。最后晾干。

(2)取出胶板,置于染色缸中,在2μg/ml的EB染色液中,暗处染色5到10分钟。

(3)蒸馏水漂洗2次,每次5分钟。

稍晾干,滤纸吸去多余水分,尽快在荧光显微镜下观察。

从胶板制备开始到最后都应该在暗光下操作。

辐射生物剂量:此法适于照后短期内的剂量评价,中性条件优于碱性条件;

旁观效应:查阅了许多国外文献,尚无此方法观察旁观效应的研究报道,所以我采用此方法观察了1Gy照后的旁观效应,试验今天上午刚刚结束,结果待分析,粗略看,此法对于旁观效应还是很敏感的,此法的优势在于成本低,操作比较简单。

低剂量照射的适应性反映:本实验室的一个相关课题刚刚结提,论文在法医学与特种医学版的军事医学子版已有上传,感兴趣的可以去看。

凋亡细胞的观察:看过国外此法作出的凋亡细胞彗星图像,很漂亮,用CASP软件分析后,其曲线呈典型的双峰,而正常细胞为单峰。我的一些教训:观察凋亡细胞最好把电压、电流、和电泳时间均调低,否则,凋亡细胞中的DNA片断跑的太块,荧光下根本看不到凋亡细胞的尾巴。

注:我用的是中性条件,20V,200mA,20min, 凋亡细胞观察宜选用10V,100mA,10min。

单细胞凝胶电泳技术应用非常广泛,本单位正在进行荷瘤小鼠放疗后的淋巴细胞DNA损伤研究,初步结果:大剂量放化疗前给予小剂量照射(分不同时间),动物的淋巴细胞彗星尾长、尾矩等指标试验组均小于对照组,证明该方法在放射医学的实用性。

丁香园网友biomed96提问:

lq6688你好,本人也正要做这个实验,预实验做了两次,但什么都没看到,也不知道是什么问题,望指教。

铺3层胶,第一层100ul1%regular胶,50度烤干,第二层50000个细胞100ul0.5%低熔点胶,第三层100ul 0.5%低熔点胶。

裂解液:EDTA 100mM Nacl 2.5M Tris(10mM)pH10 1%TritonX-100 裂解 1小时

解旋液:EDTA1mM NaoH 300mM Ph>13 孵育20分钟。电泳40分钟。

染色: PI 50ug/ml染色15分钟。

结果是什么都看不到,好像一点都没染色。

另外,用软件分析能不能区分是单链损伤还是双链损伤?

丁香园网友lq6688认为:

首先,此试验的生物学原理目前还不是很清楚,Sighn和Olive这两个单细胞凝胶电泳的鼻祖首先提出的中性和碱性条件,中性条件检测双链断裂,而碱性条件检测单链断裂,有人曾提出这是为什么,我查阅了大量文献,国外文献没有具体的说明,国内文献更是人云亦云,所以,目前只能按照大家比较默认的:中性--双链,碱性--单链,这不是用软件来区分的,而是你的试验条件决定的,我看了您的裂解液ph10,所以检测结果应是单链断裂。

其次,您用的是三层三明治铺胶法,目前多数彗星试验已经少用此法,而是双层法甚至单层灌胶,有人担心双层或单层铺胶的脱胶问题,只要在凝胶的承载载体上做点文章,就解决了!我用的是双层铺胶法,我不知道您的第一层正常熔点胶为什么要烤干,是为了防治脱胶吗?我建议您采用双层法(卖瓜人不说自己的瓜苦,呵呵),这样在实验操作上可以节省时间,不必担心脱胶问题,我做了一年多了,自认为很成熟了,从来没有出现脱胶问题,(我不知道您用的凝胶承载体是什么?)。

第三,解旋20分钟应该没问题,但是我认为您的电泳时间过长,当然我不知道您的电泳条件(电压、电流、),我认为20分钟足够了,时间长了一是浪费时间,二是彗星图像不好,不利于分析。

第四,因为我用的EB染色,2ug/ml,效果很好,您用PI染色,我可能没有发言权,因为我不知道PI 的荧光激发光波长是多少,是否您的荧光条件不对?可以查查文献,这一点您对PI应该比我更了解吧。

第五,您的裂解时间有点短了,文献报道,最好不要少于1.5小时。

第六,我不知道您用的什么细胞,50000个细胞加入100ul0.5%低熔点胶,是不是细胞太多了,含细胞层的凝胶如果细胞密度过大,即使做出结果,彗星图像过于密集,头尾连接互相影响,无法分析。一般100ul0.5%低熔点胶中含400个细胞就足够了。

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