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很多细胞实验都要检测荧光,为方便大家选择合适的方法,在此简单说一下各种荧光检测方法的特点。不足的地方,欢迎大家补充:
1、流式,优点是速度快,非常适合做大数量统计,且样品只被检测一次,完全不用担心荧光淬灭的问题。缺点是只能检测荧光的有无、强度大小,无法提供空间定位信息,无法做荧光定位变化的实验;由于样品只被检测一次,因此无法对同一个样品进行连续观察。例如,做膜蛋白定位时会得到这么一个结果——用流式可以检测出信号,但是用显微镜却看不到东西,排除仪器和滤光片选择问题,很可能是核的自发荧光或非特异标记造成流式的假阳性结果。
2、荧光显微镜,刚好与流式互补,可很好地进行空间观察,判断目标蛋白的定位,但是不适合做大流量检测,估计没人能经得起时间的考验。有不同倍率的物镜选择,可以使用高倍物镜看精细结构,或用小倍率物镜做少量统计。与之搭配的CCD和软件,是系统能否发挥性能的关键。尤其是CCD,从那么多商品里选一款合适的不容易,需要了解很多知识否则只能听别人忽悠。
3、共聚焦,荧光显微镜的升级产品,具有很好的光学层切效果,能得到很好三维定位信息。但是,如果使用共聚焦的目的仅仅是为你的样品拍一张靓照,取得一张好看的图片,就让人觉得可惜了。共聚焦基本都是全自动系统,可随意定义照明区域、选择多个荧光通路和设定定时取图,所以,做Time-laps、FRAP和FRET有其独到的优势。另外,4Pi和STED又是其中的极品,具有超高的空间分辨率,只是使用不方便,未必适合做生物实验。
4、全内反射,荧光显微镜的另一种升级产品,属于近场光学范畴,只适合且最适合做膜研究,无法看到胞内信息。也是用CCD成像,但是对CCD的要求更高——个人甚至觉得对CCD的要求是没有上限的。
5、双光子,另一种共聚焦,因使用长波激发荧光,故能做深层检测(突破共聚焦的100微米极限),最典型的应用是观察活体脑组织。巨贵无比,国内没有几台,能用上的人不多——就不说了。
6、新推出的高内涵药筛系统,流式和显微镜的杂合体,使用电动载物台,可以自动地按预定程序完成实验,可做大流量检测(虽然速度慢点),而且有成像能力,可以判断定位。前段时间,国内哪装了第一台,很多人在吹,但我实在不知道其中的好处——任何一台带电动载物台的显微镜都可以达到相似的效果,只要软件支持——估计有人赚大发啦!
从以上的简介可以看出,只要是荧光样品,就应该都可使用以上仪器检测(只用TIRF受一些限制)。但是实际应用时,大家可能会碰到某些样品可以使用流式和显微镜,但是无法使用共聚焦。为什么?解释一下:
首先,荧光检测必须有激发光照明,染料被特定波长的光照射以后才能发射荧光。激发光源有两种:1)白光(汞灯、氙灯等),然后通过滤光片选择只通过特定波长的光。如检测GFP时,大家能看到蓝光照射在样品上,因为GFP的激发条件是488nm 光。但是有一点,显微镜不可能装无限多的滤光片,所以选择是有限的。2)激光,普通的激光器只能发射特定波长的光,且数量有限,常见的是405、488、514、543、633等,所以可使用的染料也是有限。因此,大家判定仪器能否满足你实验要求,务必先看看激发条件是否合适。
其次,在光检测器(PMT、CCD)前还有一块滤光片,作用是反射样品各种散射光,只通过特定波长的荧光,提高信噪比,得到干净的背景。因此,这块滤光片也决定了仪器能否满足你的实验要求(不用太担心,这个一般和激发滤光片配套,不会有太多问题)。而在光谱型共聚焦里,使用的是棱镜或衍射光栅分光,可以选择通过任意需要的波段。这对使用量子点做标记的同学特别有好处!

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