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Home / Cell /Experiment / 用流式测小牛肺动脉平滑肌细胞周期的一点总结

<< 原代心肌细胞培养方法探讨24孔板和96孔板的容积 >>

【细胞种类】小牛肺动脉平滑肌细胞第5代;
【培养液】含15%FBS的MEM液;
【固定方法】70%酒精固定;
【染色方法】PI单染法;
【具体步骤】
1、接种:以10*5/ml密度(活细胞)接种,加培养液;
2、同步化:24h后加不含FBS的MEM进行同步化12-24h;
3、加因素:弃MEM液换等量的培养液,加药物等因素培养到指定时间;
4、消化:用不含EDTA的0.25%胰酶进行消化,离心(2000转5min);
5、洗涤:用PBS液洗一边,弃上液;
6、固定:向10ml试管内加2.5ml盐水G溶液(配置方法见司徒镇强《细胞培养》)重新悬浮细胞,然后缓慢加入-20度预冷的95%酒精7.5ml,冰浴30min;(可以过夜,第二天染色)
7、PI单染法:吹散细胞后用300目尼龙滤膜过滤,然后离心,去上液;加100ul 5mg/ml RNA酶溶液,37度保温30min,然后冰浴终止酶作用;加PI染液(100ug/ml)闭光染色30min;
8、FCM测细胞周期。

【注意点】
1、同步化是为了各单个细胞处于相对的同一周期内,即“饥饿疗法”,目前虽有争议,但这一步是不可或缺的。
2、对于PI单染还是双染好,目前也是意见不一,本实验采用单染法。
3、300目尼龙滤膜过滤是为了减少聚在一起的细胞团,防治堵塞流式仪。

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