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Home / Cell /Experiment / 很好的适合初学者的细胞培养基本操作技术

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这是一篇很好的适合初学者的细胞培养基本操作,其实即使是老手,回忆一下并对照一下也是有所收获的。

贴壁细胞细胞在培养瓶长成致密单层后,继续生长的空间不足,培养基中的营养成份也消耗较多,同时代谢废物也有较多堆积,需要分瓶培养,对细胞进行传代扩增。

对于贴壁不太紧的细胞如293,可以直接吹散后分瓶。而对于贴壁较紧的细胞如CHO,则需要以胰酶消化后再吹散分瓶,一般过程为 (以下操作均按无菌操作的要求进行):

  • 将长成致密单层细胞的细胞瓶中原来的培养液弃去;

  • 加入0.25%胰酶溶液,视细胞瓶的大小加入体积为0.5ml或更多,以使充分浸润;

  • 一般消化时间约为1至3分钟,肉眼观察瓶壁半透明的细胞层,当见到出现细针孔空隙时,弃去胰酶溶液,并加入适量的细胞培养液终止消化;

  • 视实验要求分入多瓶继续培养,一般为一传二到一传四的比例。

这里,胰酶消化的程度是一个关键:消化过度则对细胞的活性损伤较大,并有部分细胞漂浮,随弃去的胰酶流失;消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下,反复吹打同样也会损伤细胞活性。 影响消化速度的因素较多,主要有胰酶溶液的活性(配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等)、消化时的温度(气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度)以及所加胰酶溶液的多少等 。以笔者的经验,以轻吹或加培养液后轻摇可下较好,但对于经验不太充分的实验者而言是较难判断掌握的。 下面将细胞生长及不同消化程度的光学显微镜照片列出以供参考。

所用细胞为CHO贴壁细胞,培养基为含10%小牛血清的DMEM-F12,倒置显微镜10X40, 数码相机300万像素。

取细胞冻存管一支,于40°C水中速融;25ml细胞方瓶中加入含10%COSMIC小牛血清的DMEM-F12培养基10ml,将冻存管中细胞全部洗入瓶中,置37°C 2.5%二氧化碳孵箱中静置培养。4小时后倒去全部培养基以去除冻存液,更换10ml培养基,同上静置培养。

经24小时培养后,生长情况为:

经48小时培养后,细胞已长成致密单层:

致密单层细胞在细胞瓶上呈雾状,使瓶壁呈半透明:

弃去培养液,在此可先摇动细胞瓶,使老化死亡贴壁情况不好的细胞随培养液弃去。

加入2.5%胰酶后,细胞逐渐皱缩变圆,细胞间隙增大不再致密:

刚加入胰酶,细胞仍呈致密单层:

细胞开始皱缩但不明显,仍维持细胞正常形态:

细胞明显皱缩变小,细胞间隙增大不再致密,部分细胞维持正常形态,部分细胞皱缩变圆:

细胞基本皱缩变圆,此时细胞吹打可下:

细胞完全皱缩变圆,此时应弃去胰酶,加入培养基后轻摇可将细胞从细胞瓶壁上洗下,将细胞悬液用吸管吹散后传代:

有经验后,可肉眼对光观察帖壁半透明的细胞层,判断消化程度。

如消化过头,会见到许多细胞脱落随弃去的胰酶溶液流失。也可以在倒数第二、三步时弃去胰酶,用瓶中残留的胰酶继续作用至最后一步的消化程度,这样略有点过也影响不大。

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